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Na+ K+-ATP 酶活性測定說明書(可見分光光度法)
點擊次數:2145 更新時間:2019-11-11

貨號:YJ2218                                                  規(guī)格:50管/24樣

Na+ K+-ATP 酶活性測定說明書

可見分光光度法

正式測定前務必取 2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

Na+ K+- ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中,可催化ATP水解生成 ADP和無機磷。

測定原理:

Na+ K+-ATP 酶分解ATP生成ADP及無機磷,通過測定無機磷的量來確定 ATP 酶活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸

餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

試劑三:液體 5ml×1 瓶,4℃保存。

試劑四:粉劑×3支,-20℃保存。用時每支加1mL蒸餾水,現用現配。用不完的試劑-20℃

可保存一周。

試劑五:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入 3mL 蒸餾水, 4℃保存。

試劑七:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。

試劑八:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。

試劑九:液體 25mL×1 瓶,室溫保存。

試劑十:10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL標準磷應用液配制:將貯備液20倍稀釋,即取0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水

         充分混勻。

定磷劑的配制:按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染,定磷劑現用現配。

樣品酶液的制備:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

操作步驟

1、分光光度計預熱 30min以上,調節(jié)波長至660nm,蒸餾水調零。

2、酶促反應(在 EP 管中加入下列試劑)

 

對照管  

測定管

試劑一(μL)    

130

90

試劑二(μL)    

40

40

試劑三(μL)    

40

40

試劑四(μL)    

40

40

試劑五(μL)  

 

40

樣本 (μL)  

 

200

混勻,37℃(哺乳動物)或 25℃(其他物種)準確水浴 10min

試劑六(μL)    

50

50

樣本 (μL)

200

 

混勻,8000g,25℃離心 10min,取上清液

3 定磷(在 1.5mLEP 管中依次加入下列試劑)

 

空白管

標準管

對照管

測定管

0.5μmol/ml 標準磷

應用液(μL)

 

100

 

 

上清液(μL)

 

 

100

100

蒸餾水(μL)

100

 

 

 

定磷試劑(μL)

1000

1000

1000

1000

混勻,室溫放置 30 min,在 660nm 處比色。

注意:

1、由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒50管保證測24份 Na+ K+ -ATP 酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。

3、空白管和標準管只要做一管。

計算

1、血清(漿)Na+ K+-ATPase 活力的計算:

定義:每小時每毫升血清(漿)中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na+ K+-ATP酶活力(μmol/h/mL)=[C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A

空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

2、組織、細菌或細胞中 Na+ K+-ATPase 活力的計算:

(1)按蛋白濃度計算:

定義:每小時每毫克組織蛋白中 Na+ K+-ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na+ K+-ATP酶活力(μmol/h /mg)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A 空白管)÷(Cpr×V 樣)÷T =7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

定義:每小時每克組織中Na+ K+ -ATP 酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

 

Na+ K+-ATP 酶活力(μmol/h/g)= [C標準管×V總]×(A測定管-A 對照管)÷(A標準管-A 空白管)÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

定義:每小時每1萬個細菌或細胞中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na+ K+-ATP 酶活力(μmol/h /104)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)

 

C 標準管:標準管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應總體積,0.5mL;V 樣:加入樣本體

積,0.2mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1/6 小時;Cpr:樣本蛋白質

濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。

 

AP-MX-EP說明書(無內毒素質粒大量試劑盒)
Tris-硼酸電泳緩沖液(5×TBE)

滬公網安備 31011802001676號

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