甲硝唑酶聯(lián)免疫試劑盒
說(shuō)明書(shū)
一、藥物概述及檢測(cè)原理
甲硝唑抗菌藥，主要用于治療和預(yù)防滴蟲(chóng)、阿米巴原蟲(chóng)及厭氧菌引起的感染。
本公司的甲硝唑酶聯(lián)免疫試劑盒使用xing生物技術(shù)開(kāi)發(fā)，具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)。
本試劑盒利用甲硝唑抗體與甲硝唑可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和甲硝唑抗體，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的甲硝唑藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競(jìng)爭(zhēng)甲硝唑抗體，再加入酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，hou加入底物催化顯色。此時(shí)顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）中甲硝唑藥物的含量成反比。
二、試劑盒內(nèi)包含組分：
標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb，1 mL/瓶。
96孔酶標(biāo)板：1塊
甲硝唑抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）
酶標(biāo)Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）
20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
組織樣品處理液Ⅰ：1瓶（干粉，選配，如有需求請(qǐng)向廠家索取)
牛奶樣本處理液：1瓶（10ml/瓶，選配，如有需求請(qǐng)向廠家索取）
復(fù)溶工作液：1瓶（50 mL/瓶）
底物A液：1瓶（7mL/瓶）
底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
終止液：1瓶（7mL）
說(shuō)明書(shū)
蓋板膜
自封袋
三、用戶(hù)需要自備的設(shè)備和試劑
儀器：
酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm、630 nm）
電子天平（精度：0.01 g）
離心機(jī)（3000 g及以上）
生化培養(yǎng)箱（可調(diào)4℃，25℃）
搖床
旋渦振蕩器
氮吹儀
微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
計(jì)時(shí)器
試劑：（試劑均為分析純）
乙酸乙酯
正己烷
氫氧化鈉
濃鹽酸
四、試劑盒特異性
試劑盒與其他甲硝唑藥物的交叉反應(yīng)率：
v 甲硝唑…………………………………100%
五、樣本檢測(cè)步驟
1. 1工作液準(zhǔn)備
v 組織樣品處理液Ⅰ：將粉末藥品溶于200ml去離子水即得（如有需求請(qǐng)向廠家索取）。
v 組織樣品處理液Ⅱ：準(zhǔn)確量取400 mL乙酸乙酯和100 mL正己烷，充分混勻后待用。
v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
v 0.1M NaOH：稱(chēng)取0.8 g NaOH，加入200 mL去離子水溶解。
v 1M HCL：量取1ml濃鹽酸，加入11mL去離子水溶解混勻。
2. 2樣品前處理
組織（雞肉、豬肉）（稀釋倍數(shù)：0.5）
Ø 精確稱(chēng)取2 g均質(zhì)后的組織樣品于50 mL塑料離心管中；
Ø 加入2 mL組織樣品處理液Ⅰ（見(jiàn)5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）以使處理液Ⅰ與樣本充分接觸；
Ø 加入8 mL組織樣品處理液Ⅱ（見(jiàn)5.1），充分震搖（或渦動(dòng)）3 min（注：若實(shí)驗(yàn)室配置有搖床，可充分震搖1min后使用搖床300rpm 25℃震搖10分鐘）；
Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 取4 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中；
Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；
Ø 加入2 mL正己烷，再加入0.5 mL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min（或渦動(dòng)30 s）；
Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上，離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。
蜂蜜（稀釋倍數(shù)：0.5）
Ø 稱(chēng)取2.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中；
Ø 加入2ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見(jiàn)5.1），強(qiáng)烈震搖使蜂蜜溶解；
Ø 加入4ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min（或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)3min）使樣本與有機(jī)相充分接觸；
Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；
Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖2min（或渦動(dòng)1min）；
Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。
原奶方法一（稀釋倍數(shù)：5）
Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
Ø 加入50μL 1M鹽酸（見(jiàn)5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
v 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min；
Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入400μL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
Ø 取50 μL液體進(jìn)行分析。
原奶方法二（稀釋倍數(shù)：1）
Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出2ml樣本加入50ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
Ø 加入100μL 牛奶樣本處理液，再加入6ml乙酸乙酯，強(qiáng)烈震搖5min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)1min）；
Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 取1.5 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中；
Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；
Ø 加入1 mL正己烷，再加入0.5 mL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min（或渦動(dòng)30 s）；
Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上，離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。
生蛋方法一（稀釋倍數(shù)：1）
Ø 量取1ml全蛋樣本至50ml塑料離心管中；
Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見(jiàn)5.1），8ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min（或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)3min）使樣本與有機(jī)相充分接觸；
Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 移取4ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；
Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，1ml正己烷，強(qiáng)烈震搖2min（或渦動(dòng)1min），離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。
生蛋方法二（稀釋倍數(shù)：5）
Ø 取出1ml樣本加入2ml離心管中；
Ø 加入100μL 1M鹽酸（見(jiàn)5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
Ø 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min；
Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中，再加入400μL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
Ø 取50 μL液體進(jìn)行分析。
熟蛋（稀釋倍數(shù)：2）
Ø 稱(chēng)取1g熟蛋樣本至50ml塑料離心管中；
Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見(jiàn)5.1），8ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min（或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)3min）使樣本與有機(jī)相充分接觸；
Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；
Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，1ml正己烷，強(qiáng)烈震搖2min（或渦動(dòng)1min），離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。
3. 3檢測(cè)
準(zhǔn)備：將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，為減小檢測(cè)值波動(dòng)建議做雙孔平行實(shí)驗(yàn)（每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)兩孔），未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；
加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL抗體工作液；
孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于4℃避光反應(yīng)60 min；
洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開(kāi)蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍干；
加酶：在每孔中加入100 μL酶標(biāo)Ⅱ抗工作液（洗滌后的酶標(biāo)板在加酶前不宜在室溫環(huán)境過(guò)長(zhǎng)時(shí)間放置，以防微孔干燥導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異）；
孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)20min；
洗滌：按照前面敘述的方法再次洗滌酶標(biāo)板；
顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；
孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min；
終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍(lán)變黃表明終止成功。
讀數(shù)：終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長(zhǎng)讀取酶標(biāo)板吸光度值。
4計(jì)算結(jié)果
設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標(biāo)準(zhǔn)（濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比：
使用半對(duì)數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可得出樣品對(duì)應(yīng)的濃度，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測(cè)物含量。
六、試劑盒參數(shù)
Ø 試劑盒靈敏度：0.1 ppb；
Ø 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.1 ppb-8.1 ppb；
Ø 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%；
Ø 板間變異系數(shù)：<15%；
Ø B0吸光度jia值：>0.8；
Ø 回收率：90%±30%
Ø 樣品低檢測(cè)限：
豬肉、雞肉…………………………………………約0.5 ppb
蜂蜜…………………………………………………約0.1 ppb
原奶方法一…………………………………………約1 ppb
原奶方法二…………………………………………約0.2ppb
生蛋方法一…………………………………………約0.5 ppb
生蛋方法二…………………………………………約1.5 ppb
熟蛋……………………………………v……………約1 ppb
注：ppb=ng/mL或ng/g。
七、分析限制
本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，建議使用儀器方法開(kāi)展確證實(shí)驗(yàn)（如GC/MS、LC-MS/MS等）。
八、試劑盒貯存條件及有效期
Ø 試劑盒貯存在2-8℃有效期為一年，切勿凍存。
Ø 未使用完的酶標(biāo)板條須密封保存2-8℃的環(huán)境中。
九、注意事項(xiàng)
Ø 使用試劑盒前，請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。
Ø 試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組份置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。
Ø 試劑在使用前許搖勻，混合時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。
Ø 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測(cè)過(guò)程中所用槍頭不得重復(fù)使用。
Ø 請(qǐng)勿使用過(guò)期試劑盒，不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用。
Ø 樣品處理完畢后請(qǐng)立即分析，否則可能影響檢測(cè)結(jié)果。
Ø 底物A液、底物B液均為無(wú)色透明液體，若在使用前已變成藍(lán)色，或混合后立即變藍(lán)，說(shuō)明試劑已污染或變質(zhì)。
Ø 加樣過(guò)程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應(yīng)時(shí)間差對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。
Ø 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請(qǐng)立即用大量清水沖洗。若不shen入眼，請(qǐng)?jiān)?清洗后去醫(yī)院檢查。
