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TB基因分型試劑盒VNTR-9詳細操作步驟
點擊次數(shù):1401 更新時間:2022-02-18

TB基因分型試劑盒 VNTR-9

目錄號:k2570

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TB基因分型試劑盒VNTR-9.png

 

其它相關(guān)產(chǎn)品        

k2571

TB  基因分型試劑盒 HV-3

 

產(chǎn)品簡介

 

本試劑盒是以分子流行病學新一代研究進展

1

為基礎(chǔ),經(jīng)工藝優(yōu)化后形成的人型結(jié)核分枝桿菌基因分型產(chǎn)品。本產(chǎn)品利用

結(jié)核分枝桿菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem repeats, VNTR)多態(tài)性進行基因型分型區(qū)分臨

床菌株,是研究結(jié)核分枝桿菌分子流行病學和監(jiān)測結(jié)核病傳播狀況的有力工具。與現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結(jié)核分枝桿菌

VNTR分型系統(tǒng)相比,這一分型系統(tǒng)對中國流行的菌株具有更強的分辨能力123,因此特別適合于中國用戶的需求。

通過對各PCR反應(yīng)引物序列和預(yù)混反應(yīng)液成份進行精心優(yōu)化,使得本產(chǎn)品具有很強的抗干擾力。與用戶自配試劑相比,

本產(chǎn)品顯著提升了特異條帶信號強度,降低了使用粗制模板(煮沸菌液)時非特異條帶的出現(xiàn)率,使實驗操作更加簡便、快

捷的同時,提高了檢測成功率。本產(chǎn)品的預(yù)混反應(yīng)液化學穩(wěn)定性良好,能有效抵抗反復(fù)凍融(10次)和較長時間(一周)

的室溫環(huán)境,更好地適應(yīng)了用戶檢測工作中的靈活性需求。

本產(chǎn)品將人型結(jié)核分枝桿菌(MTBC)鑒定、非結(jié)核分枝桿菌(MOTT)及模板質(zhì)量鑒定、結(jié)核分枝桿菌北京家族菌株

鑒定,和后續(xù)的9位點VNTR分型鑒定整合在一個試劑盒中,使用戶僅需一個試劑盒、12PCR反應(yīng)即可獲得待測菌株基因

型鑒定所需的完整信息。檢測的分辨力指數(shù)(Hunter-Gaston indexHGI)可達0.989  。并且,基因型鑒定結(jié)果可數(shù)字

化記錄,使得不同樣本批次,不同地區(qū),不同時間,不同研究者之間的實驗數(shù)據(jù)可以很方便地進行比對和匯集分析,

提高了數(shù)據(jù)的使用效率。

對鑒定為VNTR-9基因型成簇(所有9個位點具有相同重復(fù)數(shù))的樣本,若要判定菌株間是否存在近期傳播關(guān)系,需使用

配套產(chǎn)品TB基因分型試劑盒HV-3(貨號K2571),做進一步的分型鑒定。VNTR-9HV-3兩個產(chǎn)品的結(jié)合使用可將檢測

HGI提升至0.993  。關(guān)于TB基因分型試劑盒HV-3(貨號K2571)產(chǎn)品的更多信息請見其產(chǎn)品說明書。

1

參考文獻

1Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium

tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)

2Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping

Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)

3Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype

strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.

注意事項

1.為避免污染,建議制備樣本和配制 PCR Mix 在不同的地點內(nèi)進行,并使用不同的移液器。

2.在樣本 DNA 的收集,抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)注意作好標記,同時防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。

3.常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。

4.每管 PCR Mix 中均含有不同的引物,不可混用。可根據(jù)實驗需求一次性分裝為不同的量,避免反復(fù)凍融。

5.為避免打開反應(yīng)管時,反應(yīng)液飛濺,開蓋前請短暫離心,收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手

套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。

6.吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix,建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。

7.

實驗前準備:1×TE  緩沖液(PH=8.0)、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、普通 PCR 儀、DNA 電泳設(shè)備和

凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應(yīng)管、八聯(lián)排或 96 PCR 管、不同規(guī)格的移液器:0.5-10 μl 20-200 μl

 

操作步驟

1.

DNA 模板制備:

1.1  從固體培養(yǎng)基上刮取少量(1-2 接種環(huán))樣本,重懸于 100 μl TE 中,80°C 滅活 30 分鐘。

1.2  滅活后的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作:

100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時 EP 管蓋子可能會爆開,要盡量避免,扣緊 EP 管,不要讓水進入管中),立即置于冰上 2

分鐘,12,000 rpm~13,400×g)離心 10 分鐘后,取上清置于另一無菌 EP 管中,做上標記,-20°C 保存。

2.

檢測程序:

2.1   取出 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9,待液體平衡到室溫后,輕微搖晃 3-4 次混勻,12,000 rpm 離心 5 秒,使蓋上的

液體收集到管內(nèi)。

2.2  結(jié)核分枝桿菌基因型分析:

2.2.1  鑒定樣本是否為人型結(jié)核分枝桿菌(重要!此步驟不可省略!):

APCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl

在每個 PCR 管中分別加入 19 μl Mtb 鑒定 PCR Mix1 μl DNA 模板,混勻。


B.反應(yīng)程序:

TB基因分型試劑盒VNTR-9.333png.png

C.

制膠,電泳

使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳。

配制 1%的瓊脂糖凝膠,12×6 cm 膠盤制膠,每塊膠為 40 ml

1)稱取 0.4 g 瓊脂糖,加入 40 ml 0.5×TBE,在天平上稱重后放入微波爐,高火加熱 2-3 分鐘,使瓊脂糖*溶化,搖

勻,觀察為均一透明溶液,無顆粒,再在天平稱量,補入適量的雙蒸水,以保持膠凝膠的濃度不受影響。

2)待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 2 μl 溴化乙錠(10 ug/ml),輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠,將

溫熱的凝膠澆灌入膠盤。

3)待凝膠*凝結(jié)(室溫下放置 30 分鐘),小心拔出梳子,取出托盤,放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液,

沒過膠面 1-2 mm

4PCR 產(chǎn)物上樣:每個孔中加入 3 μl PCR 產(chǎn)物,每塊膠上留一個孔加入 5  μl MarkerⅠ,每塊膠上加一個 H37Rv

為質(zhì)量控制。電壓 150V,電泳時間為 45 分鐘。

結(jié)果顯示:

TB基因分型試劑盒VNTR-9.332png.png

 

D.結(jié)果分析:

1)如果出現(xiàn)了 850 361 bp 兩條帶,則說明模板 DNA 是人型結(jié)核分枝桿菌,可進入第 F 步(見后面)進行結(jié)核分枝桿

菌北京基因型的分析鑒定,并進一步使用本試劑盒對該菌株進行 9 位點 VNTR 基因型分析鑒定。

2)如果只擴增出 850 bp 的條帶,則說明該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,但不是人型結(jié)核分枝桿菌,不適用本產(chǎn)品進行

基因型分析鑒定。

4)如果沒有特異性條帶擴增,則說明該菌株是非結(jié)核分枝桿菌或模板 DNA 質(zhì)量不好,不適用本產(chǎn)品進行基因型分析鑒定,

可放棄該樣本,或進入第 E 步(見后面),檢測 DNA 模板的質(zhì)量。

EDNA 模板質(zhì)量鑒定:

若在以上步驟 A-D 中沒有特異性條帶擴增,則說明模板 DNA 質(zhì)量不佳或該菌株并非結(jié)核分枝桿菌,出現(xiàn)此種情況請

進行如下操作。

1PCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl

在每個 PCR 管中分別加入 19 μl 16S rRNA PCR Mix1  μl DNA 模板,混勻。

2)反應(yīng)程序:

 

TB基因分型試劑盒VNTR-9.444png.png

3)電泳

1%瓊脂糖凝膠電泳,150V 電泳 45 分鐘;

4)結(jié)果顯示:

TB基因分型試劑盒VNTR-9.442png.png

5)結(jié)果分析:

所有細菌中都存在 16S rRNA 序列,如果樣本無擴增產(chǎn)物,說明模板 DNA 的數(shù)量或質(zhì)量不足以進行 VNTR 基因分型

檢測。如果有擴增產(chǎn)物條帶出現(xiàn),則說明此菌株為非結(jié)核分枝桿菌,不應(yīng)使用本試劑盒進行基因分型鑒定。

F.北京基因型菌株鑒定方法:

在確定菌株為結(jié)核分枝桿菌后,進一步區(qū)分是否屬于北京基因型菌株。

1PCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl

在每個 PCR 管中分別加入 19 μl RD105 PCR Mix1  μl DNA 模板,混勻。

2)反應(yīng)程序:

TB基因分型試劑盒VNTR-9.555png.png

3)電泳

1%瓊脂糖凝膠電泳,150V 電泳 45 分鐘。

4)結(jié)果顯示:

TB基因分型試劑盒VNTR-9.552png.png

5)結(jié)果分析:

如果擴增產(chǎn)物為 1495 bp,該菌株為非北京基因型菌株;

如果擴增產(chǎn)物為 786 bp,該菌株為北京基因型菌株。

2.2.2  結(jié)核分枝桿菌 9 位點 VNTR 基因型分型法:對結(jié)核分枝桿菌臨床菌株進行基因型分析,初步鑒定成簇菌株。

APCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl

9 PCR 反應(yīng)管,在每個 PCR 管中分別加入 19  μl QUB-11bQUB-18QUB-26MIRU26MIRU31MIRU40

Mtub21Mtub04VNTR2372 PCR Mix,加入 1 μl DNA 模板,混勻。

B .  反應(yīng)程序:

TB基因分型試劑盒VNTR-9.553png.png

C.  制膠、電泳:

C-1注意事項:

重要每次實驗需要設(shè)置陽性(H37Rv 菌株 DNA)和陰性對照(去離子水)。

關(guān)鍵!本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎(chǔ)來判讀 VNTR 位點基因型,因此,為了使不同實驗室結(jié)果能準確的相互比較,

在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標準操作,應(yīng)注意以下幾點:

1)  制膠所用梳子為 18 孔。

2) 凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形,影響結(jié)果判讀,舍棄不用,或者在其中一個孔點上陰性對

照,剩余 16 孔分為 12 個樣本,3 DNA Marker 1 個陽性對照。點樣順序分別為“12M3456M

78910M1112H37Rv”,數(shù)字代表樣本,M 代表 DNA Marker

3PCR 擴增產(chǎn)物進行首ci電泳并使用 Marker  I 時,凝膠濃度為 1%,應(yīng)使用兩電極間距離不小于 30 厘米的電泳槽,電

壓為 150V,時間為 100-120 分鐘。

4) 如果擴增產(chǎn)物片段過大(>1000bp),需要再次電泳并使用 Marker  II 時,凝膠濃度為 0.8%,應(yīng)使用兩電極間距離不

小于 30 厘米的電泳槽,電壓 150V,時間為 150 分鐘。

C-2:制膠以及電泳過程:

使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳。

配制 1%的瓊脂糖凝膠,12×12 cm 膠盤制膠,每塊膠為 80 ml

1)稱取 0.8 g 瓊脂糖,加入 80 ml 0.5×TBE,在天平上稱重后放入微波爐,高火加熱 2-3 分鐘,使瓊脂糖*溶化,搖勻,

觀察為均一透明溶液,無顆粒,再在天平稱量,補入適量的雙蒸水,以保持膠的濃度不受影響。

2)待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠(10 ug/ml),輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠,將溫

熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。

3)待凝膠*凝結(jié)(室溫下放置 40 分鐘),小心拔出梳子,取出托盤,放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液,

沒過膠面 1-2 mm

4)上樣電泳:每塊膠中加入 12 個樣本(最邊上的孔不加樣),每個孔中加入 3-5 μl PCR 產(chǎn)物,同時每塊膠上加三個 5 μl

DNA MarkerⅠ,加一個 H37Rv 作為質(zhì)量控制(點樣孔分布見下圖)。電壓 150V,電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟

是各位點最終讀數(shù)是否準確的關(guān)鍵,需要統(tǒng)一按照此標準操作。

5)部分位點(QUB-18 QUB-26)在臨床菌株中存在擴增產(chǎn)物大于 1000 bp 的情況,對這些擴增產(chǎn)物再利用 0.8%瓊脂

糖凝膠進行電泳,同時加入 DNA MarkerⅡ 作為條帶大小對照,電壓 150V,電泳時間 150 分鐘。

Marker

TB基因分型試劑盒VNTR-9.777png.png

 

Marker

TB基因分型試劑盒VNTR-9.772png.png

 

 

D.  結(jié)果分析:

根據(jù)各臨床菌株擴增條帶與 Marker 相對位置,利用凝膠分析軟件讀出每個條帶的大小。利用各 VNTR 位點重復(fù)單元讀

數(shù)表及 VNTR 位點讀數(shù)規(guī)則,計算出各菌株在該位點的重復(fù)單元數(shù),每個 VNTR 位點重復(fù)單元讀書表及 VNTR 位點讀數(shù)規(guī)

則附后。

結(jié)果報告:  Excel 文件(以下表格為結(jié)果報告輸出格式舉例)

TB基因分型試劑盒VNTR-9.888png.png

比較不同菌株 9 VNTR 位點的重復(fù)數(shù),進行成簇分析:如果兩個或兩個以上菌株具有相同 9 位點基因型,則初步鑒

定為成簇菌株,如有必要,可使用配套產(chǎn)品,K2571TB  基因分型試劑盒  HV-3,做更精細的進一步分型鑒定。如果

分離的菌株具有特異的 9 位點基因型,則鑒定為單一菌株。

附錄 1VNTR 位點讀數(shù)規(guī)則

TB基因分型試劑盒VNTR-9.999png.png

 

附錄 2 VNTR 位點重復(fù)單元讀數(shù)表

TB基因分型試劑盒VNTR-9.10png.png

TB基因分型試劑盒VNTR-9.1111png.png

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