牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說明書 |
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牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說明書 【產(chǎn)品名稱】 通用名稱：牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法） 英文名稱：Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method) 【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒 【預(yù)期用途】 本試劑盒利用改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光PCR原理，主要用于牛傳染性胸膜肺炎的定性篩查檢測。 【檢驗(yàn)原理】 本試劑盒針對牛傳染性胸膜肺炎基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含有牛傳染性胸膜肺炎 DNA模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。 【主要組成成份】
注：陰性對照為不含牛傳染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物，陽性對照為牛傳染性胸膜肺炎經(jīng)滅活處理的核酸提取物。 【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。 【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。 【樣本要求】 1. 動物組織樣本采集后取10mg～100mg用滅菌生理鹽500μL～1000μL水研磨，離心后取上懸液備用，避免標(biāo)本間交叉污染。 2. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃，長期保存不會影響本試劑盒檢測結(jié)果，但有可能影響培養(yǎng)法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 3. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。 【檢驗(yàn)方法】 1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)） （1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。 （2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。 n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。 (4) 蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管和試劑盒中的DNA提取液轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。 2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)） 用本公司病毒核酸提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。或按以下方法操作： a.取試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。 b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。 c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。 d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測。 3.加樣 在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)） （1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。 （2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。 【陽性判斷值或者參考區(qū)間】 1.試劑盒有效性判定： （1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。 2.標(biāo)本結(jié)果判定： （1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。 （2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。 （3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。 【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
【檢驗(yàn)方法的局限性】
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的低檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。 【注意事項(xiàng)】
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