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ATP 含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

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ATP 含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意:本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

  貨號(hào):

規(guī)格:100T/96S

產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系技術(shù)人員。

微量法

試劑名稱(chēng)規(guī)格保存條件

提取液液體 100 mL×1 瓶4℃保存

試劑一液體 20 mL×1 瓶4℃保存

試劑二粉劑×1 瓶4℃保存

試劑三液體 4 mL×1 瓶4℃保存

試劑四粉劑×2 支-20℃保存

試劑五粉劑×1 瓶4℃保存

試劑六粉劑×2 支-20℃保存

標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1 支-20℃保存

溶液的配制:

1、 試劑二:臨用前加入 3.5 mL 蒸餾水充分溶解,可加熱促進(jìn)溶解;

2、 試劑四:臨用前取 1 支加入 0.2 mL 蒸餾水溶解,可分裝后-20℃保存,避免反復(fù)凍融;

3、 試劑五:臨用前加入 1 mL 蒸餾水;

4、 試劑六:臨用前取 1 支加入 0.25 mL 蒸餾水備用,可分裝后-20℃保存,避免反復(fù)凍融;

5、 標(biāo)準(zhǔn)品:5 mg ATP。臨用前加入 0.826 mL 蒸餾水配成 10 μmol/mL 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液;

6、 工作液的配制:臨用前請(qǐng)按試劑二(mL):試劑三(mL):試劑四(mL):試劑五(mL):試劑六(mL)=1:1:0.1:

0.4:0.1 的比例配制,現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明:

ATP 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是生物能量通貨,能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定 ATP 含量并且計(jì)算能荷,能夠反映能量代謝狀態(tài)。

HK 催化葡萄糖和 ATP 合成 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成 NADPH, NADPH 在 340nm 有特征吸收峰,NADPH 和 ATP 含量成正比,以此反應(yīng) ATP 含量。

技術(shù)指標(biāo):

最低檢出限:0.0026 μmol/mL

線性范圍:0.01953-3 μmol/mL

注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/ 96 孔 UV 板、研缽/勻漿器、蒸餾水和氯

仿。

操作步驟:

一、樣本處理

1、 血清(漿)中 ATP  的提取:按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約

0.1mL 血清(漿),加入 1mL  提取液),充分震蕩,10000g,4℃離心 10min;取上清液至另一 EP  管中,加入

500μL 的氯仿充分震蕩混勻,10000g 4℃離心 3min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。

2、 組織中 ATP  的提取:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g  組織,加入

1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4℃離心 10min,取上清至另一 EP  管中,加入 500μL 的氯仿充分震蕩混勻,10000g 4℃離心 3min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。

3、 細(xì)胞或細(xì)菌中 ATP  的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104  個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎 1min(冰浴,強(qiáng)度 20%或 200W,超聲 2s,停 1s),10000g 4 ℃離心 10min;取上清液至另一 EP 管中,加入 500μL 的氯仿充分震蕩混勻,10000g 4℃離心 3min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 將 10μmol/mL 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋 16 倍即 0.625μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 加樣表:在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入

試劑名稱(chēng)(μL)測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管

樣本20

標(biāo)準(zhǔn)液20

試劑一128128

工作液5252

充分混合后,立即測(cè)定 340nm 下 10s 的吸光值 A1,然后將比色皿連同反應(yīng)液一起放入 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其他物種)水浴中反應(yīng) 3min,拿出擦拭干凈立即測(cè)定其在 3min10s 時(shí)的吸光值 A2。用96 孔板則放入 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其他物種)培養(yǎng)箱中(酶標(biāo)儀若自帶控溫功能,則將溫度調(diào)

至 37℃或 25℃)。分別計(jì)算ΔA 測(cè)定=A2 測(cè)定管-A1 測(cè)定管,ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A2 標(biāo)準(zhǔn)管-A1 標(biāo)準(zhǔn)管。

三、ATP 含量計(jì)算

1、 血清(漿)中 ATP 含量計(jì)算

ATP  含量(μmol/mL) =ΔA 測(cè)定÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn))×(V 提取+V 血清(漿))÷V 血清(漿)

=6.875×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)

2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 ATP 含量計(jì)算

(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算

ATP 含量(μmol/g 質(zhì)量)= ΔA 測(cè)定÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn))×V 提取÷W

=0.625×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷W

(2)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

ATP 含量(μmol/106 cell)=ΔA 測(cè)定÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn))×V 提取÷5

=0.125×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)

C 標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)液濃度,0.625μmol/mL;V 提取:加入的提取液體積,1mL;V 血清(血漿):血清(漿)體積,

0.1mL;W:樣本質(zhì)量,g;5:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),5×106 個(gè)。

注意事項(xiàng):

1、 加入提取液離心后的上清若為渾濁為正常現(xiàn)象。

2、 提取過(guò)程嚴(yán)格在冰浴條件下進(jìn)行。

3、 如果吸光值大于 1.5,建議將樣本用提取液稀釋后進(jìn)行測(cè)定。

4、 提取液低溫條件下,可能有結(jié)晶析,放于 60℃水浴溶解即可,不影響使用。

從2011年開(kāi)始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及論文潤(rùn)色服務(wù),協(xié)助客戶(hù)各類(lèi)實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤(rùn)色十多年,是您值得信賴(lài)的科研合作伙伴!

如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無(wú)法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

 

實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù):

 



滬公網(wǎng)安備 31011802001676號(hào)

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