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產(chǎn)品名稱：狗腫瘤浸潤組織白細胞分離液試劑盒

（細胞培養(yǎng)及分子生物學）說明書

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

 名稱 產(chǎn)品編號 規(guī)格

A 各種動物外周血白細胞分離液 詳見附錄 1 2×100ml

B 紅細胞裂解液（贈品） NH4CL2009 100ml

C 全血及組織稀釋液（贈品） 2010C1119 100ml

D 細胞洗滌液（贈品） 2010X1118 100ml

注：本試劑內(nèi)容中各單品可根據(jù)貨號單獨購買，客戶可根據(jù)實際使用情況自行選擇購買。

【預(yù)期用途】

適用于從動物抗凝血液中分離白細胞，無菌條件下所分離的白細胞可用于分子生物學及

細胞培養(yǎng)等。本品僅供科研使用。

【檢驗原理】

本分離液為 FICOLL、羥乙一基淀粉 550 與泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝血液可在分離液

中分層。離心時，在 FICOLL、羥乙一基淀粉的作用下紅細胞與粒細胞聚集并迅速沉降；此時，

白細胞仍處于分離液上層及分離液層，紅細胞污染可通過紅細胞裂解液裂解紅細胞去除。大

部分血小板可在細胞清洗低速離心過程中去除。

其他人及動物多種比重細胞分離液，因不同種屬不同比重分離液的細胞離散系數(shù)及細胞

帶電不同，用戶在制定分離液時應(yīng)提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。

【*但不提供的儀器及耗材】

可提供 400g 離心力的水平轉(zhuǎn)子離心機、15ml 玻璃離心管、吸管等。

【注意事項】

1. 使用前，本分離液需復(fù)溫至 18-22℃。為獲得*的實驗結(jié)果，在取血后 2 小時內(nèi)

進行實驗，血液提取后存放時間越長細胞活性越低。

2. 實驗過程中，如需稀釋血液或洗滌細胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其

成分會導(dǎo)致血細胞凝集大大降低細胞得率及純度。本公司生產(chǎn)的全血及組織稀釋液和細胞洗

滌液不含 Ca、Mg 離子、低內(nèi)毒素水平且含細胞和保護成分，推薦使用。

3. *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素，其他抗凝劑也可使用，但會影響細胞活性。應(yīng)

注意在血液稀釋過程中去除抗凝劑體積。

4. 當血液樣本粘度過高或血液樣本大于等于 3ml 時，*稀釋方法：將血液于 18-22℃以

250g 離心 10 分鐘，棄去血漿，補充添加全血及組織稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119），添

加量為所棄去血漿體積的 1.5-2 倍，混勻備用。注：不當?shù)南♂尫椒〞档图毎寐始盎钚浴?/span>

5. 實驗操作時，不可使用含粉手套、不可使用內(nèi)毒素含量過高的液體，手套中的粉末顆粒

及高內(nèi)毒素會激活細胞從而降低細胞得率及活性。

6. 本實驗不可使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，其帶有的靜電作用將導(dǎo)致細胞

貼壁影響分離效果。

7. 吸取過多的白細胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細

胞數(shù)量增加。

8. 吸取過多的白細胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

9. 如需進行細胞計數(shù)，則需血液貯藏時間不得多于 10 小時，否則將導(dǎo)致細胞被激活，得率降低。

10. 為去除所混雜的血小板，可在分離液上層加上 4-20%蔗糖梯度等滲溶液進行二次離心。

11. 細胞純度可在步驟 10 后使用瑞氏染色方法確定，細胞活性可用臺盼藍處理后觀察。

12. 如所實驗后細胞得率或活性過低，請?zhí)旖驗笠詫で髱椭唧w

詳見“【生產(chǎn)企業(yè)】”項目下內(nèi)容。

【檢驗方法】

情況 A: 血液樣本小于 3ml 時，實驗方法如下：

1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液置于 18-22℃。

2. 將血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g 離心 20 分鐘。低溫（如 4 度）離

心會降低細胞得率。

3. 離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含白細胞的細胞層）0.5cm 以上的上清液部分，

棄去。

4. 用吸管小心吸取分離液層、白細胞層及紅細胞層置于另一新離心管內(nèi)。

5. 在步驟 4 中所得離心管中加入 10ml 細胞洗滌液（產(chǎn)品編號：2010X1118）混勻。

6. 250g 離心 10 分鐘。

7. 棄上清，沉淀使用紅細胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細胞（裂解過程參見下述【紅

細胞裂解液使用說明】）。

8. 裂解后再經(jīng)三次洗滌去除紅細胞內(nèi)溶物和碎片后即為所需白細胞。

9.后以 0.5ml 后續(xù)試驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

情況 B: 血液樣本大于等于 3ml 時，實驗方法如下：

1. 首先按“【注意事項】第 4 條”所述方法稀釋血液樣本。

2. 取一支適當?shù)碾x心管，加入分離液（加入量與稀釋后的血液樣本體積相等），置于

18-22℃。

3. 將經(jīng)稀釋處理的血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g 離心 20 分鐘。低溫

（如 4 度）離心會降低細胞得率。注：加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過

離心管總體積的三分之二。

4. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟

【紅細胞裂解液使用說明】

本裂解液有別于市場上銷售的其它紅細胞裂解液，其配方經(jīng)過本公司優(yōu)化在裂解紅細

胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte)或其它有細胞核的細胞，所獲

得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài)。另外，本裂解液中無DNA及RNA酶，配

合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養(yǎng)及分子生物學實驗，請廣大用戶從優(yōu)選擇。

紅細胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱ACK Lysis Buffer，是一種用于

從人或鼠等的血液或組織細胞樣品中裂解并去除無細胞核紅細胞的溶液。

本裂解液不適用于有細胞核紅細胞的裂解，例如鳥或禽類的紅細胞。本裂解液經(jīng)過無菌

處理，處理過的血液或組織細胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各種常規(guī)的分析和檢測。

使用說明：

A. 對于組織細胞樣品：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 加入3-5倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體

積為1ml，則加入3-5ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清。可再重復(fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

White Blood

Cell

f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

B. 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 對于0.2ml細胞沉淀加入1ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫

或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：對于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同

時不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管。

C. 對于血液樣品：

a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。

b. 加入6-10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體

積為1ml，則加入6-10ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對于鼠

的血液，裂解1-2分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至4-5分鐘，并且裂

解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清。可再重復(fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：對于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進行離心棄上清的操作，直接在第二步中加入10倍血

液體積的紅細胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外

周血，宜延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。后續(xù)步驟相同。

D. 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟：

a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。

溫或4度操作均可。注意：對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜

延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促

進紅細胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：對于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時

不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管。

【儲存條件及有效期】

18-25℃避光保存，有效期 2 年。啟封后置 4℃保存，溶液變渾濁或感染細菌時，產(chǎn)品

失效。本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【適用儀器】

半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子離心機。

【樣本要求】

本分離液要求血液為新鮮的抗凝血，血液收集時應(yīng)無菌操作且在儲存、處理和運輸過

程中避免冷凍和冷藏。

【參考值（參考范圍）】

本實驗白細胞的提取率及純度均大于 80%。

【檢驗結(jié)果的解釋】

由于各品牌離心機的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效

果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心的時間，摸索*的分離條件（具體分離條件各實驗室自

定）。

【檢驗方法的局限性】

本試驗要求，在正常大氣壓下，樣本、分離液及分離環(huán)境溫度為 18-22℃。本分離液在

低溫時呈較高密度，在高溫時呈較低密度。

【產(chǎn)品性能指標】

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μ m 以上的不溶性微粒 20 粒以下，含

μ m 以上的不溶性微粒 5 粒以下

【參考文獻】

1 鄭德先，吳克復(fù)，褚建新.現(xiàn)代實驗血液學研究方法與技術(shù).北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大

學聯(lián)合出版社，1999

2 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社，1995

3 朱立平，陳學清.免疫學常用實驗方法.人民軍醫(yī)出版社，2000